近年来，CRISPR/Cas9系统被广泛应用，最初是用于基因编辑，如今也用于转录激活。将核酸酶失活的Cas9与转录激活结构域相融合，人们能够上调几乎所有基因。在Addgene的博客上，哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的Marcelle Tuttle和Alex Chavez就针对这一操作提出了一些实用的建议。

Cas9激活物的最佳用途之一是基因筛选。利用寡核苷酸文库合成，可轻松获得靶定人类基因组中每个基因的gRNA。在此之前，利用其他的DNA结合蛋白也曾获得类似的工具，如锌指（ZF）和TAL效应物（TALE）。与它们不同的是，Cas9可轻松改变所靶定的序列，你只需要准备一个新的gRNA，而不需要一个全新的蛋白。这让Cas9激活物更加经济。

你可能会说，cDNA文库的作用也差不多啊，它包含的质粒可以过表达特定细胞类型的编码序列。不过，与gRNA相比，这些文库难以构建和导入。此外，cDNA不能用于顺式调控的研究，也无法轻松导入特定基因的异构体，因为很多时候，特定细胞中的异构体是未知的。而Cas9激活物在天然背景下激活基因，能有效解决这些问题。

不过，你需要知道，尽管Cas9激活物是一种十分强大的工具，但未必适合每种应用。举个例子，如果你只想激活单个基因，那么Cas9激活物也许不是一个好的选择，因为有多个因素可能阻止你的基因被上调。比如，在天然条件下基因的表达量越高，利用Cas9可实现的激活就越少。你的基因可能已经达到激活的上限，那么Cas9也帮不了你。此外，激活实验往往需要大量的调整。对于你想要激活的每个基因，你需要准备3-4个向导RNA，因为它们的效果可能大相径庭

当然，如果将Cas9激活物用于大规模的全基因组筛选，这几乎不成问题，因为若基因不能正确上调，充其量是错过一个，而不是整个实验失败。因此，当用户想要激活单个基因时，Tuttle和Chavez建议使用cDNA过表达载体，而不是浪费很多时间来做Cas9的troubleshooting。

最后，专家指出，尽管Cas9激活物在体外实验中非常有用，但这种技术还未用于体内实验。大多数Cas9激活物比较大，难以放入最常用的载体 – 腺相关病毒（AAV）中。不过，未来更小的Ca9同源物和转录因子有可能与AAV兼容，同时保留了诱导基因表达的能力。

目前有许多种激活物可用在你的实验中。面对林林总总的选择，你可能有点犯愁。专家表示，对于多个细胞系（HEK293T、MCF7、U2-OS、Hala、N2A、3T3）和生物，SAM、Suntag和VPR都是不错的选择。他们的建议是，选择你最常用的，选择你最熟悉的。

至于脱靶效应，这在Cas9激活物中通常不被认为是个大问题。之前的RNA-Seq实验也证实，Cas9脱靶跑到另一个基因的启动子上的几率非常低。话虽这么说，Tuttle和Chavez通常还是将基因的启动子放入gRNA finder中（如WU-CRISPR或sgRNA scorer 1.0），从中挑选出最接近转录起始位点（TSS）的向导RNA。他们建议让sgRNA靶定TSS上游200 bp内的区域，这样结果最好，不过400 bp以内的区域也不错。